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凝膠分離范圍及分離膠的有效分離(組圖)!
發布時間:2022-09-02 16:03:13 瀏覽 280次 鞏義市維納凈水材料有限公司

1 背景介紹:

SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳成立于1967年,并于1969年進一步完善。他們發現在樣品培養基和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑(SDS)后,蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基的分子量,電荷因子可以忽略。

2 SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳原理:

(1)陰離子去污劑SDS破壞蛋白質分子間和其他物質分子間的非共價鍵,使蛋白質變性并改變其原有構象,與蛋白質分子充分結合形成帶負電荷的蛋白質-SDS復合物。

(2)SDS結合的蛋白質在水溶液中的形狀類似于一個長橢圓桿。橢圓桿的短軸長度對于不同的蛋白質-SDS復合物是恒定的,而長軸與蛋白質的分子量有關。與大小成正比。

(3)在電場作用下,這種蛋白質-SDS復合物的遷移率不再受蛋白質原有凈電荷和形狀的影響,主要取決于其分子量。根據針對這一特性,可以根據分子量分離出各個蛋白質成分。

收集凝膠

電泳開始時,氯離子的電泳速率最高,高于蛋白質,所以后面形成了一個低電導區,電場強度與低電導成反比面積,因此產生較高的電場強度,使蛋白質和甘氨酸離子快速移動,形成穩定的界面,使蛋白質在移動的界面附近聚集并凝聚成中間層。

分離膠

孔徑小。通過選擇合適的凝膠濃度,可以很好地分離樣品。當樣品進入分離凝膠時,凝膠的pH值和孔徑發生變化,使慢離子的遷移率增加,超過蛋白質,高強度的動力裝置消失。因此,蛋白質以均勻的 pH 值和電場強度通過分離凝膠。如果蛋白質分子量不同,通過分離膠的阻力不同,遷移速度也不同,可以根據蛋白質的分子量進行分離。

凝膠分離范圍

有效分離范圍

SDS聚丙烯酰胺 凝膠取決于用于澆注凝膠的 聚丙烯酰胺 的濃度和交聯度。在沒有交聯劑的情況下聚合的丙烯酰胺會形成毫無價值的粘性溶液,而用雙丙烯酰胺交聯會增加凝膠的剛度和拉伸強度,并形成必須通過小孔的 SDS-蛋白質復合物。這些小孔的孔徑隨著“亞甲基雙丙烯酰胺與丙烯酰胺”比例的增加而減小,當比例接近1:20時孔徑達到最小值。大部分SDS聚丙烯酰胺凝膠是按照“雙-丙烯酰胺-丙烯酰胺”的比例為1:29制備的。測試表明,它可以分離大小差異僅為3%的蛋白質。

凝膠的篩分性能取決于其孔徑,而孔徑又是用于傾倒凝膠的丙烯酰胺和雙丙烯酰胺的絕對濃度的函數。 5-15%丙烯酰胺凝膠的線性分離范圍如下表所示:

雙丙烯酰胺與丙烯酰胺的摩爾比為1:29

3 系統中各組件的作用:

(1)SDS功能:SDS是一種陰離子表面活性劑,可以與蛋白質分子結合形成一定比例的帶負電荷的復合物,再結合PAGE技術,條帶差異更加明顯,很清楚,可以確定蛋白質的分子量。SDS帶有大量的負電荷,當它與蛋白質結合時,負電荷大大超過了蛋白質原有的負電荷,從而消除或掩蓋了蛋白質之間的原有電荷。不同類型的蛋白質。所有蛋白質都具有相同的負電荷密度,因此可以利用分子量的差異來分離各種蛋白質。

(2)運行緩沖液中的甘氨酸:樣品和濃縮膠中的氯離子形成移動界面的前邊界,而甘氨酸分子形成后邊界,兩個邊界之間存在電導移動界面 電位滴度較低和較陡的區域,它將樣品中的蛋白質向前推并在分離凝膠的前部積累。此處較高的 pH 值有利于甘氨酸的離子化,甘氨酸在填充的蛋白質中形成并跟隨氯化物

(3)上樣緩沖液功能:蛋白上樣緩沖液(SDS-PAGE)是以溴酚藍為染料的5倍濃縮SDS-PAGE凝膠電泳上樣緩沖液。用于常規SDS-PAGE蛋白電泳上樣. 一般在上樣緩沖液中加入一定濃度的甘油或蔗糖,可以增加樣品的比重,上樣緩沖液中的甘油很重要,起到增加粘度的作用,這樣可以防止樣品從梳狀孔擴散到電泳緩沖液中。指示劑檢測電泳進度,一般加入移動較快的溴酚藍指示電泳前沿。

4 個實驗步驟:

凝膠制備→凝膠填充(填充分離凝膠→添加蒸餾水→填充濃縮凝膠)→插入梳子→添加緩沖液(上下)→拔出梳子→添加樣品→蓋上蓋子打開電泳儀電源→染色→脫色

立式電泳儀

電泳時的分子遷移規律,小分子在前,大分子在后。電泳凝膠相當于凝膠過濾中的多孔凝膠顆粒。

電泳后的凝膠照片用考馬斯亮藍染色并脫色

5 實驗注意事項

(1)成膠試劑必須有足夠的純度:丙烯酰胺是成膠液中最重要的成分,其純度直接影響凝膠的質量,丙烯酰胺可能混入一些影響凝膠形成的雜質包括:丙烯酰胺、線性聚聚丙烯酰胺、金屬離子等。

(2)與氧化劑混合后很容易被氧化失去催化能力,其他氧化產物呈黃色,可以鑒別品質。如果不能得到無色透明的,只有適當增加用量才能保證聚合物膠的速度。

(3)過硫酸銨易吸潮,因溶于水后迅速降解,失去催化能力,所以潮解過硫酸銨會逐漸失去活性。固體過硫酸銨應密封,

(4)活化劑的用量:活化劑的濃度是否合適,不僅決定凝膠聚合的速度非離子聚丙烯酰胺,而且影響凝??膠的質量。增加過硫酸銨或丙烯酰胺的用量,使丙烯酰胺聚合物鏈的長度變短時,凝膠會變脆,失去彈性,當聚合物鏈的長度過短時,肉眼看不到凝膠,而這些短鏈聚合物在溶液中,但其粘度比聚合前高。

(5)溫度的影響:聚膠的最佳溫度是23~25℃,需要注意單體溶液(一般放在4℃冰箱里)和玻璃板或試管(有時在澆注前從烘箱中取出)也應平衡至此溫度。由于溶液在抽真空過程中仍保持低溫,因此需要在升至室溫后進行脫氣,并且速率加熱后氧氣的脫氣在較低溫度下更快。

(6)氧氣的作用:氧氣會與活化的單體自由基發生反應,抑制聚合過程聚丙烯酰胺凝膠電泳槽,所以在加入活化劑之前需要對單體溶液進行脫氣。如果省略這一步,縮合的膠水仍然可以聚合但需要更多的活化劑,不能保證良好的重復性,充分去除氧氣可以用盡可能少的活化劑得到最好的聚合效果。通常在良好的真空下(<)脫氣至少15分鐘。

(7)凝膠添加劑:凝膠中經常加入SDS、尿素、X-100等添加劑。SDS的加入不會影響凝膠的聚合,但尿素會使凝膠孔徑變大更小,此功能可用于分離小分子蛋白質或多肽。

(8)聚合時間:雖然在過硫酸銨/催化膠合15~20分鐘后可以觀察到凝膠的形成,但至少需要90分鐘才能保證95%以上的單鏈聚合。生長時間短,孔徑合適,使用核黃素時聚合時間需要較長,但一般用于等電聚焦,即根據蛋白質的電荷性質進行分離,對聚合時間要求不高孔徑,因此無需等待很長時間(完全聚合需要8小時。

(9)單體濃度:指溶液中單體總重量(丙烯酰胺+雙)的百分比(w/v),可選范圍為3%~30%,單體當濃度增加,聚合速度加快,催化劑用量可適當減少。

(10)SDS與蛋白質的結合量與質量成正比(即:1.4g SDS/g蛋白質),蛋白質含量不得超標,否則結合量為SDS 不足。

(11)有些蛋白質由亞基(如血紅蛋白)或兩條以上的肽鏈(α-糜蛋白酶)組成,在巰基乙醇和SDS的作用下解離成亞基或多條單肽鏈. 因此,對于這類蛋白質,SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳只測定其亞基或單肽鏈的相對分子量。

6 常見問題解答:

(1)質地和拖尾現象:由于樣品溶解性差,克服的方法可以是加樣前離心,加入尿素等增溶助劑。

(2)蛋白條帶太寬:與相鄰泳道的蛋白條帶連接處是由于上樣量過多,可減少上樣量。

(3)電泳時間比正常時間長:可能是凝膠緩沖系統和電極緩沖系統的pH選擇錯誤。

(4)指標為笑臉符號(指標正面呈向上曲線):表示凝膠冷卻不均勻,中間部分冷卻不充分,導致不同分子流動性。

(5)凝膠時間錯誤:一般30分鐘內凝膠凝固。如果凝固太慢,可能是APS劑不夠或失效。

(6)一種“皺眉”(往下和兩邊中間):主要發生在立式蛋白電泳槽中,一般兩板之間的底部間隙還沒有完全去除。處理:可用在兩板之間加入適量的緩沖液去除氣泡。

(7)如何處理“鬼帶”:“鬼帶”是未知的大分子,在運行具有復雜大分子構象的蛋白質分子時,經常出現在泳道的頂部(有時在堆積凝膠中)條帶或樣品孔底部有沉淀,主要是還原劑在加熱過程中被氧化而失去活性,使原來解離的蛋白質分子重新折疊并與亞基重新締合聚合成具有分子的大分子重量,比目標條帶大,有時不能進入分離膠,但與目標條帶具有相同的免疫活性,在WB反應中可以看出它可以與目標條帶對應的抗體發生反應。處理方法:加熱煮沸后,加入適量的DTT或β-巰基乙醇補充不足的還原劑;或加入適量的EDTA至防止還原劑氧化。

(8)為什么溴酚藍不能起到指示作用:我們經常遇到溴酚藍已經跑出板底,但蛋白質還沒有跑下來的現象。主要是與緩沖液有關,與分離膠濃度有關。處理方法:更換正確的pH值;降低分離膠濃度。

2轉移電泳()

蛋白質樣品經SDS-PAGE電泳后,將凝膠中所含的樣品蛋白質條帶轉移并固定在一定韌性和化學惰性的聚合物載體(如尼龍膜、硝酸纖維素NC膜、聚合物偏二氟乙烯上) (PVDF膜),膜上的蛋白質或多肽作為抗原,與相應的一抗和酶標二抗反應,未結合的抗體用合適的溶液沖洗,含有底物的溶液樣品中的特定蛋白質(抗原)成分可以通過在培養基中孵育并顯示條帶來檢測。

兩種常用的電轉印方法是濕轉印和半干轉印,除了用于固定膠水/薄膜疊層和施加電場的機械裝置外,它們在原理上是相同的。

濕法轉移是一種傳統的方法,將凝膠/膜疊層浸入緩沖液中,然后施加電壓。

這是一種高效的方法,但速度慢,需要大量緩沖區,并且只能使用一種類型的緩沖區。

此外,這種方法難以轉移二維電泳中??常用的大凝膠。

濕轉印系統一般在恒壓條件下進行。在傳輸過程中,混合緩沖器保持電壓相對恒定。

半干轉

半干轉,用浸有緩沖液的多層濾紙更換緩沖罐。由于電極板與濾紙直接接觸,因此凝膠中的電場強度盡可能大,以實現快速高效的轉移。

與濕轉印相比,此方法速度快(15-45 分鐘)且效果好。大多數半干轉移方法可以使用一種以上的緩沖系統來有效地同時轉移不同大小的蛋白質。

但是,由于緩沖液較少,半干式印跡系統不適合較長時間的轉印。

半干轉印非常適合在大型二維凝膠上進行印跡。

半干式吸墨紙一般采用恒流條件,在轉印過程中電壓逐漸升高。也可提供恒定電壓條件(小于 25V)。

實驗操作流程圖

PAGE→轉移膜(PVDF或硝酸纖維素膜)→封閉→一抗→洗滌→酶標二抗反應→洗滌→顯色或化學發光

印跡轉移膜的選擇

1.孔徑選擇:通常當目標分子量小于20kD時,選用孔徑為0.22um的膜。一般使用0.45um孔徑。

2.膠片選材

1)硝酸纖維素膜(NC):純度很重要,純度越高,結合蛋白越強。背景低,價格便宜。缺點是結合蛋白量低于PVDF膜。

2)PVDF膜:結合蛋白量幾乎是NC膜的6倍。缺點是后臺高,價格貴聚丙烯酰胺凝膠電泳槽,操作麻煩。

3)尼龍膜:結合蛋白量大,缺點是:背景高,現在很少用了。

3. 選擇不同的膜轉移緩沖液:NC 膜,少 SDS。

濕法電泳

1)將轉膜剪成與凝膠相同的大小。

2) 在 100% 甲醇中均勻潤濕 PVDF 膜(約 2-3 秒),在水中沖洗 2-3 分鐘,然后在轉移緩沖液中平衡至少 10 分鐘。

3)電泳后,將凝膠在轉移緩沖液中平衡 5 分鐘。

4)將凝膠放在同樣浸泡在緩沖液中的濾紙上,然后將 PVDF 膜放在凝膠上并蓋上濕濾紙(避免層間氣泡),最后將它們夾在一起放入轉移箱中.

5)根據待轉移蛋白的分子量設置恒定工作電流和轉移時間。一般分子量為20KD的蛋白質可以用50V電壓從0.5mm厚的凝膠中轉移,時間大約為轉移大分子量蛋白質所需的時間相應增加,但在實驗中可以發現,當蛋白質的分子量大于10-時,即使轉移到45-,膜上吸附的蛋白質量仍然不盡如人意。另外,如果使用Tris-甘氨酸緩沖液,電壓為40V,需要1-4h。

6)轉膜后,取出膜,用超純水沖洗2~3次,每次5分鐘,除去膜上電泳和電印跡所用的緩沖液。

如果用于氨基酸分析:轉膜緩沖液首選CAPS,因為CAPS對后續氨基酸組成分析和蛋白質序列測定影響不大。此外,CAPS 在 pH 11 時具有良好的緩沖能力,可確保大部分蛋白質帶負電并朝向正電移動。

印跡:通常也可以使用 Tris-甘氨酸系統進行電印跡,但在轉移后,需要更徹底地沖洗膜以去除可能粘附的緩沖離子和其他雜質。

半干式電泳

1、將膜和濾紙剪成與凝膠相同的大小。

2、準備傳輸緩沖區。

陽極緩沖液 I:0.3M Tris,10% 甲醇,pH10.4;

陽極緩沖液 II:25mM Tris,10% 甲醇,pH10.4;

陰極緩沖液:25mM Tris、40mM 6-氨基己酸、10% 甲醇,pH9.4(也可以使用 40mM 甘氨酸)。

水浴轉印用CAPS緩沖液:也可用于半干轉,但轉印效率不如上述系統,尤其是蛋白含量極少時,希望蛋白盡可能多盡可能將其轉移到膜上進行進一步分析。

3、將 PVDF 膜在 100% 甲醇中潤濕 2-3 秒,用超純水沖洗 2-3 分鐘,然后在陽極緩沖液 II 中平衡至少 10 分鐘。

4、電泳后在陰極緩沖液中平衡凝膠 5 分鐘。

5、按以下順序放置在轉移槽的陽極板上:3mm 濾紙浸泡在陽極緩沖液 I、PVDF 膜、凝膠、3mm 濾紙浸泡在負緩沖液中。

6、根據待轉移蛋白的特性設置合適的電流和時間。一般原則為1.8mA/cm2, 1 h。由于半干轉印不易散熱,因此電印跡應在 4°C 下進行(在冰箱或冰柜中)。

7、轉膜后,用超純水沖洗膜2-3次,每次5分鐘,去除Tris和甘氨酸。然后將膜放在濾紙上自然晾干,再用20%甲醇溶液稍微潤濕,在白光(如熒光燈)下看到灰白色蛋白條帶印記,染色步驟可省略, 并對該印跡進行了進一步分析。但是,當電泳前的樣品中含有大量雜質蛋白和鹽類時,該方法不易區分,仍需染色。

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    TAG:緩沖液 電泳 sds

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